Скандал

Дмитрий Воробьевский (Россия)   24.03.2020 15:22

https://www.nature.com/articles/nm.3985 (Машинный перевод англоязычной научной статьи 2015 года об искусственной трансформации коронавируса летучих мышей в коронавирус, пригодный для того, чтобы вызвать эпидемию или даже пандемию среди людей. Согласно имеющимся данным, эти научные исследования были начаты в США, однако затем признаны незаконными, и их финансирование там было прекращено, в связи с чем они были продолжены в Институте вирусологии Китайской академии наук, в городе Ухани, где и началась нынешняя пандемия. Ссылка на комментарий в Фейсбуке, где можно прочитать о некоторых подробностях по данной теме -- https://www.facebook.com/dimvds/posts/2892204627492586?comment_id=2892258447487204 . Сначала прилагаю короткую цитату из этой статьи, а затем и её текст.):

"...Чтобы расширить эти данные, первичные культуры эпителия дыхательных путей человека (HAE) были инфицированы и показали надежную репликацию обоих вирусов (рис. 1d). Вместе эти данные подтверждают способность вирусов со Спайком SHC014 заражать клетки дыхательных путей человека и подчеркивают потенциальную угрозу межвидовой передачи SHC014-CoV. ..."
________________


"Опубликовано: 09 Ноября 2015 Г.
Похожий на торс кластер циркулирующих коронавирусов летучих мышей показывает потенциал для появления человека
Винеет Д Menachery, Бойд Л Янт Младший, Кари Debbink, Судхакар Agnihothram, Лиза Электронная Gralinski, Джессика В Планте, Рейчел L Грэм, Тревор Скоби, Син-Йи Ге, Эрик Ф Дональдсон, Ч Скотт Рэнделл, Антонио Lanzavecchia, Уэйн В Мараски, Zhengli-Ли Ши & Ральфа Барич
Nature Medicine volume 21, pages1508-1513 (2015)цитируйте эту статью

1.11 м подъезды

94 цитаты

6249 Altmetric

Metricsdetails

Исправление к этой статье было опубликовано 06 апреля 2016 года
Эта статья была обновлена
Абстрактный
Появление коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (торс-ков) и ближневосточного респираторного синдрома (БВРС)-КоВ подчеркивает угрозу межвидовой передачи событий, приводящих к вспышкам заболевания у людей. Здесь мы исследуем потенциал заболевания вирусом, похожим на торс, SHC014-CoV, который в настоящее время циркулирует в популяциях китайских подковообразных летучих мышей1. Используя систему обратной генетики SARS-Cov2, мы сгенерировали и охарактеризовали химерный вирус, экспрессирующий Спайк коронавируса летучих мышей SHC014 в адаптированном к мышам позвоночнике SARS-CoV. Полученные результаты показывают, что вирусы группы 2b, кодирующие Спайк SHC014 в позвоночнике дикого типа, могут эффективно использовать множественные ортологи рецептора атипичного ангиотензинпревращающего фермента человека II (ACE2), эффективно реплицироваться в первичных клетках дыхательных путей человека и достигать титров in vitro, эквивалентных эпидемическим штаммам атипичной пневмонии. Кроме того, эксперименты in vivo демонстрируют репликацию химерного вируса в легких мыши с заметным патогенезом. Оценка имеющихся иммунотерапевтических и профилактических методов лечения ОРВИ показала их низкую эффективность; как моноклональные антитела, так и вакцинальные подходы не смогли нейтрализовать и защитить от инфекции ков с использованием нового спайкового белка. На основании этих результатов мы синтетически воссоздали инфекционный полноразмерный рекомбинантный вирус SHC014 и продемонстрировали надежную вирусную репликацию как in vitro, так и in vivo. Наша работа предполагает потенциальный риск повторного возникновения торс-ков от вирусов, циркулирующих в настоящее время в популяциях летучих мышей.

Главный
Появление торс-ков ознаменовало собой новую эру в межвидовой передаче тяжелых респираторных заболеваний с глобализацией, ведущей к быстрому распространению по всему миру и массовым экономическим последствиям 3, 4. С тех пор несколько штаммов—включая штаммы гриппа А H5N1, H1N1 и H7N9 и БВРС-КоВ—появились в популяциях животных, вызывая значительные заболевания, смертность и экономические трудности для пострадавших регионов5. Хотя меры общественного здравоохранения смогли остановить вспышку атипичной пневмонии ков 4, недавние метагеномические исследования выявили последовательности тесно связанных с атипичной пневмонией вирусов,циркулирующих в китайских популяциях летучих мышей, которые могут представлять будущую угрозу1, 6. Однако только данные о последовательностях дают минимальную информацию для идентификации и подготовки к будущим препандемным вирусам. Поэтому, чтобы изучить потенциал возникновения (то есть потенциал заражения человека) циркулирующих ков летучих мышей, мы построили химерный вирус, кодирующий новый зоонозный ков—спайковый белок-из последовательности RsSHC014—ков, которая была выделена из китайских подковообразных летучих мышей1-в контексте адаптированного к атипичной пневмонии костяка мыши. Гибридный вирус позволил нам оценить способность нового спайкового белка вызывать заболевание независимо от других необходимых адаптивных мутаций в его естественном костяке. Используя этот подход, мы охарактеризовали ков-инфекцию, опосредованную спайковым белком SHC014 в первичных клетках дыхательных путей человека и in vivo, и проверили эффективность доступных иммунотерапевтических средств против SHC014-ков. Вместе эта стратегия преобразует данные метагеномики, чтобы помочь предсказать и подготовиться к будущим появлениям вирусов.

Последовательности SHC014 и связанного с ними RsWIV1-CoV показывают, что эти ков являются ближайшими родственниками эпидемических штаммов SARS-CoV (рис. 1a, b); однако существуют важные различия в 14 остатках, которые связывают человеческий ACE2, рецептор для SARS-CoV, включая пять, которые являются критическими для диапазона хозяина: Y442, L472, N479, T487 и Y491 (ref. 7). В WIV1 три из этих остатков отличаются от эпидемического штамма SARS-CoV Urbani, но они, как ожидалось, не изменят связывание с ACE2 (дополнительный рис. 1а, в и дополнительная таблица 1). Этот факт подтверждается обоими экспериментами по псевдотипированию, которые измеряли способность лентивирусов, кодирующих спайковые белки WIV1, проникать в клетки, экспрессирующие человеческий ACE2 (дополнительный рис. 1) и анализами репликации in vitro WIV1-CoV (ref. 1). Напротив, 7 из 14 остатков ACE2-взаимодействия в SHC014 отличаются от таковых в SARS-CoV, включая все пять остатков, критичных для диапазона хостов (дополнительный рис. 1С и дополнительная таблица 1). Эти изменения вкупе с неспособностью псевдотипированных лентивирусов, экспрессирующих Спайк SHC014, проникать в клетки (дополнительный фиг. 1d), предположил, что Спайк SHC014 не способен связывать человеческий ACE2. Однако было сообщено,что аналогичные изменения в родственных штаммах SARS-CoV позволяют связывать ACE27, 8, что предполагает необходимость дополнительного функционального тестирования для верификации. Поэтому мы синтезировали Спайк SHC014 в контексте реплицирующе-компетентного, адаптированного к мышам костяка SARS-CoV (далее мы будем называть химерный ков SHC014-MA15), чтобы максимизировать возможности для изучения патогенеза и вакцинации у мышей (дополнительный рис. 2а). Несмотря на предсказания как структурного моделирования, так и экспериментов по псевдотипированию, SHC014-MA15 был жизнеспособным и реплицировался до высоких титров в клетках Vero (дополнительный рис. 2b). Подобно атипичной пневмонии, SHC014-MA15 также требовал функциональной молекулы ACE2 для входа и мог использовать ортологи ACE2 человека, циветты и летучей мыши (дополнительный рис. 2С, г). Чтобы проверить способность шипа SHC014 опосредовать инфекцию дыхательных путей человека, мы исследовали чувствительность клеточной линии эпителиальных дыхательных путей человека Calu-3 2B4 (ref. 9) к инфекции и обнаружена устойчивая репликация SHC014-MA15, сравнимая с таковой при ОРВИ-ков Урбани (рис. 1С). Чтобы расширить эти данные, первичные культуры эпителия дыхательных путей человека (HAE) были инфицированы и показали надежную репликацию обоих вирусов (рис. 1d). Вместе эти данные подтверждают способность вирусов со Спайком SHC014 заражать клетки дыхательных путей человека и подчеркивают потенциальную угрозу межвидовой передачи SHC014-CoV.


Рис. 1: атипичные вирусы размножаются в клетках дыхательных путей человека и продуцируют патогенез in vivo.
Рисунок 1
а) полнометражные геномные последовательности репрезентативных ков были выровнены и филогенетически нанесены на карту, как описано в онлайновых методах. Шкала шкалы представляет собой нуклеотидные замены, причем маркируется только поддержка bootstrap выше 70%. Дерево показывает ков, разделенных на три различные филогенетические группы, определенные как α-ков, β-ков и γ-ков. Классические кластеры подгрупп обозначаются как 2a, 2b, 2c и 2d для β-ков и как 1a и 1b для α-ков. (b) аминокислотные последовательности доменов S1 спайков репрезентативных β-ков группы 2b, включая SARS-ков, были выровнены и филогенетически картированы. Шкала весов представляет собой аминокислотные замены. (С,D) репликацию вирусов SARS-коронавирус Урбани (черный) и SHC014-МА15 (зеленый) после заражения культуры клеток 3 2В4 (С) или высокодифференцированными, первичный воздух-жидкость Хэ клеточных культур (Д) при множественности заражения (МВД) в размере 0,01 для обоих типов клеток. Образцы были собраны в отдельные моменты времени с биологическими репликами (n = 3) как для экспериментов Calu-3, так и для экспериментов HAE. (e,f) потеря веса (n = 9 для SARS-CoV MA15; n = 16 для SHC014-MA15) (e) и репликация вируса в легких (n = 3 для SARS-CoV MA15; n = 4 для SHC014-MA15) (f) 10-недельных мышей BALB/c, инфицированных 1 × 104 p.F.u. мышей, адаптированных к SARS-CoV MA15 (черный) или SHC014-MA15 (зеленый) через интраназальный (i.n.) путь. (g,h) показаны репрезентативные изображения срезов легких, окрашенных на антиген SARS-CoV N от мышей, инфицированных SARS-CoV MA15 (n = 3 мыши) (g) или SHC014-MA15 (n = 4 мыши) (h). Для каждого графика центральное значение представляет среднее значение группы, а полосы ошибок определяют шкалу s.e.m., равную 1 мм.

Полноразмерное изображение
Чтобы оценить роль Спайка SHC014 в опосредовании инфекции in vivo, мы заразили 10-недельных мышей BALB/c 104 бляшкообразующими единицами (p. f. u.) либо SARS-MA15, либо SHC014-MA15 (рис. 1e-h). Животные, инфицированные SARS-MA15, испытывали быструю потерю веса и летальность при 4-дневной постинфекции (d. p. i.); напротив, инфекция SHC014-MA15 приводила к существенной потере веса (10%), но не летальности у мышей (рис. 1е). Исследование вирусной репликации выявило почти эквивалентные вирусные титры из легких мышей, инфицированных SARS-MA15 или SHC014-MA15 (рис. 1f). В то время как легкие у мышей, инфицированных SARS-MA15, показали сильное окрашивание как в терминальных бронхиолах, так и в легочной паренхиме 2 d.p.i. (рис. 1g), у мышей, инфицированных SHC014-MA15, наблюдалось снижение окрашивания антигеном дыхательных путей (рис. 1Н); напротив, в паренхиме или в общей гистологической картине не наблюдалось дефицита антигенного окрашивания, что свидетельствует о дифференциальной инфекции легочной ткани для SHC014-MA15 (дополнительная таблица 2). Затем мы проанализировали инфекцию у более восприимчивых животных в возрасте 12 месяцев. Зараженные SARS-MA15 животные быстро теряли вес и поддавались инфекции (дополнительный рис. 3а, б). Инфекция SHC014-MA15 индуцировала устойчивую и устойчивую потерю веса, но имела минимальную летальность. Тенденции в гистологическом и антигенном окрашивании образцов, которые мы наблюдали у молодых мышей, были сохранены у более старых животных (дополнительная таблица 3). Мы исключили возможность того, что SHC014-MA15 был опосредован инфекцией через альтернативный рецептор на основе экспериментов с использованием Ace2−/− мышей, которые не показали потери веса или окрашивания антигеном после инфекции SHC014-MA15 (дополнительный рис. 4а, В и дополнительная таблица 2). Вместе взятые данные указывают на то, что вирусы со Спайком SHC014 способны индуцировать потерю веса у мышей в условиях вирулентного Ковенанта.

Учитывая доклиническую эффективность терапии моноклональными антителами к Эболе, например ZMApp10, мы затем попытались определить эффективность моноклональных антител к атипичной пневмонии против инфекции SHC014-MA15. Ранее сообщалось о четырех широко нейтрализующих человеческих моноклональных антителах, нацеленных на спайковый белок SARS-CoV, которые являются вероятными реагентами для иммунотерапии 11, 12, 13. Мы изучили влияние этих антител на вирусную репликацию (выраженное в процентном ингибировании вирусной репликации) и обнаружили, что в то время как атипичная пневмония дикого типа была сильно нейтрализована всеми четырьмя антителами при относительно низких концентрациях антител (Рис.1). 2a-d), нейтрализация варьировалась для SHC014-MA15. Fm6, антитело, генерируемое фагом display и escape-мутантами 11, 12, достигало только фоновых уровней ингибирования репликации SHC014-MA15 (рис. 2а). Аналогичным образом, антитела 230.15 и 227.14, которые были получены из клеток памяти в инфицированных SARS-CoV пациентах13, также не смогли блокировать репликацию SHC014-MA15 (рис. 2b, c). Для всех трех антител различия между спайковыми аминокислотными последовательностями SARS и SHC014 соответствовали прямым или смежным изменениям остатков, обнаруженным у побеговых мутантов SARS-CoV (fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q/E), что, вероятно, объясняет отсутствие нейтрализующей активности антител против SHC014. Наконец, моноклональное антитело 109.8 смогло достичь 50% нейтрализации SHC014-MA15, но только при высоких концентрациях (10 мкг / мл) (Рис.1). 2d). Вместе взятые результаты показывают, что широко нейтрализующие антитела против SARS-CoV могут иметь лишь незначительную эффективность против эмерджентных SARS-подобных штаммов CoV, таких как SHC014.

Рис. 2: моноклональные антитела к атипичной пневмонии имеют предельную эффективность в отношении атипичной пневмонии.
Рисунок 2
(a-d) анализы нейтрализации, оценивающие эффективность (измеряемую как уменьшение количества бляшек) панели моноклональных антител, которые все были первоначально сгенерированы против эпидемии SARS-CoV, против инфицирования клеток Vero SARS-CoV Urbani (черный) или SHC014-MA15 (зеленый). Тестируемые антитела были fm6 (n = 3 для Urbani; n = 5 для SHC014-MA15) 11,12 (a), 230,15 (n = 3 для Urbani; n = 2 для SHC014-MA15) (b), 227,15 (n = 3 для Urbani; n = 5 для SHC014-MA15) (c)и 109,8 (n = 3 для Urbani; n = 2 для SHC014-MA15) 13 (d). Каждая точка данных представляет собой среднее значение группы, а полосы ошибок определяют s. e. m.обратите внимание,что полосы ошибок в зараженных SARS-CoV Urbani клетках Vero в b, c перекрываются символами и не видны.

Полноразмерное изображение
Для оценки эффективности существующих вакцин против инфекции SHC014-MA15 мы вакцинировали пожилых мышей двукратно инактивированным цельным SARS-CoV (DIV). Предыдущие работы показали, что DIV может нейтрализовать и защитить молодых мышей от вызова с гомологичным вирусом14; однако вакцина не смогла защитить пожилых животных, у которых также наблюдалась усиленная иммунная патология, что указывает на возможность причинения животным вреда из-за вакцинации15. Здесь мы обнаружили, что DIV не обеспечивает защиту от вызова с SHC014-MA15 в отношении потери веса или вирусного титра (дополнительный рис. 5а, б). В соответствии с предыдущим сообщением с другими гетерологичными группами 2b CoVs15, сыворотка от DIV-вакцинированных пожилых мышей также не смогла нейтрализовать SHC014-MA15 (дополнительный рис. 5С). Примечательно, что вакцинация DIV приводила к стойкой иммунной патологии (дополнительная таблица 4) и эозинофилии (дополнительный рис. 5d-f). В совокупности эти результаты подтверждают, что вакцина DIV не будет защищать от инфекции SHC014 и, возможно, может усилить заболевание в пожилой вакцинированной группе.

В отличие от вакцинации мышей с DIV, использование SHC014-MA15 в качестве живой аттенуированной вакцины показало потенциальную перекрестную защиту от инфекции с SARS-CoV, но результаты имеют важные предостережения. Мы заразили молодых мышей 104 p. f. u. SHC014-MA15 и наблюдали их в течение 28 дней.затем мы бросили вызов мышам с SARS-MA15 на 29-й день (дополнительный рис. 6а). Предшествующее заражение мышей высокой дозой SHC014-MA15 обеспечивало защиту от вызова с летальной дозой SARS-MA15, хотя была только минимальная реакция нейтрализации SARS-CoV от антисыворотки, вызванной через 28 дней после заражения SHC014-MA15 (дополнительный рис. 6b, 1: 200). При отсутствии вторичного усиления антигена 28 d. p. i. представляет собой ожидаемый пик титров антител и подразумевает,что со временем будет снижена защита от SARS-ков 16, 17. Аналогичные результаты, свидетельствующие о защите от вызова с летальной дозой SARS-CoV, наблюдались у пожилых мышей BALB/c в отношении потери веса и репликации вируса (дополнительный рис. 6С, г). Однако инфекционная доза SHC014-MA15 в дозе 104 р. У. Е. индуцировала > 10% - ную потерю веса и летальность у некоторых пожилых животных (рис. 1 и дополнительный рис. 3). Мы обнаружили, что вакцинация с более низкой дозой SHC014-MA15 (100 p.f. u.) не вызывала потери веса, но также не смогла защитить пожилых животных от смертельной дозы SARS-MA15 (дополнительный рис. 6е, f). Вместе взятые данные свидетельствуют о том, что shc014-MA15 challenge может обеспечить перекрестную защиту от торс-ков с помощью консервированных эпитопов, но требуемая доза индуцирует патогенез и исключает использование в качестве аттенуированной вакцины.

Установив, что Спайк SHC014 обладает способностью опосредовать инфицирование клеток человека и вызывать заболевание у мышей, мы затем синтезировали полноразмерный инфекционный клон SHC014-CoV на основе подхода, используемого для SARS-CoV (рис. 3а) 2. Репликация в клетках Vero не выявила дефицита SHC014-CoV по сравнению с таковым для SARS-CoV (рис. 3b); однако SHC014-CoV был значительно (Р < 0,01) ослаблен в первичных культурах HAE как через 24, так и через 48 ч после заражения (рис. 3С). In vivo инфицирование мышей не продемонстрировало значимой потери веса, но продемонстрировало снижение вирусной репликации в легких при полноразмерной инфекции SHC014-CoV, по сравнению с SARS-CoV Urbani (рис. 3d, e). Вместе взятые результаты подтверждают жизнеспособность полноразмерного SHC014-CoV, но предполагают, что для его репликации требуется дальнейшая адаптация, эквивалентная репликации эпидемического SARS-CoV в респираторных клетках человека и мышей.

Рис. 3: полноразмерный SHC014-CoV реплицируется в дыхательных путях человека, но не обладает вирулентностью эпидемии SARS-CoV."

____________________________
_________________________



(Текст -- точнее, начало текста -- оригинала данной статьи на английском языке:
"Letter
Published: 09 November 2015
A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence
Vineet D Menachery, Boyd L Yount Jr, Kari Debbink, Sudhakar Agnihothram, Lisa E Gralinski, Jessica A Plante, Rachel L Graham, Trevor Scobey, Xing-Yi Ge, Eric F Donaldson, Scott H Randell, Antonio Lanzavecchia, Wayne A Marasco, Zhengli-Li Shi & Ralph S Baric
Nature Medicine volume 21, pages1508–1513(2015)Cite this article

1.11m Accesses

94 Citations

6249 Altmetric

Metricsdetails

A Corrigendum to this article was published on 06 April 2016
This article has been updated
Abstract
The emergence of severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) and Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV underscores the threat of cross-species transmission events leading to outbreaks in humans. Here we examine the disease potential of a SARS-like virus, SHC014-CoV, which is currently circulating in Chinese horseshoe bat populations1. Using the SARS-CoV reverse genetics system2, we generated and characterized a chimeric virus expressing the spike of bat coronavirus SHC014 in a mouse-adapted SARS-CoV backbone. The results indicate that group 2b viruses encoding the SHC014 spike in a wild-type backbone can efficiently use multiple orthologs of the SARS receptor human angiotensin converting enzyme II (ACE2), replicate efficiently in primary human airway cells and achieve in vitro titers equivalent to epidemic strains of SARS-CoV. Additionally, in vivo experiments demonstrate replication of the chimeric virus in mouse lung with notable pathogenesis. Evaluation of available SARS-based immune-therapeutic and prophylactic modalities revealed poor efficacy; both monoclonal antibody and vaccine approaches failed to neutralize and protect from infection with CoVs using the novel spike protein. On the basis of these findings, we synthetically re-derived an infectious full-length SHC014 recombinant virus and demonstrate robust viral replication both in vitro and in vivo. Our work suggests a potential risk of SARS-CoV re-emergence from viruses currently circulating in bat populations.

Main
The emergence of SARS-CoV heralded a new era in the cross-species transmission of severe respiratory illness with globalization leading to rapid spread around the world and massive economic impact3,4. Since then, several strains—including influenza A strains H5N1, H1N1 and H7N9 and MERS-CoV—have emerged from animal populations, causing considerable disease, mortality and economic hardship for the afflicted regions5. Although public health measures were able to stop the SARS-CoV outbreak4, recent metagenomics studies have identified sequences of closely related SARS-like viruses circulating in Chinese bat populations that may pose a future threat1,6. However, sequence data alone provides minimal insights to identify and prepare for future prepandemic viruses. Therefore, to examine the emergence potential (that is, the potential to infect humans) of circulating bat CoVs, we built a chimeric virus encoding a novel, zoonotic CoV spike protein—from the RsSHC014-CoV sequence that was isolated from Chinese horseshoe bats1—in the context of the SARS-CoV mouse-adapted backbone. The hybrid virus allowed us to evaluate the ability of the novel spike protein to cause disease independently of other necessary adaptive mutations in its natural backbone. Using this approach, we characterized CoV infection mediated by the SHC014 spike protein in primary human airway cells and in vivo, and tested the efficacy of available immune therapeutics against SHC014-CoV. Together, the strategy translates metagenomics data to help predict and prepare for future emergent viruses.

The sequences of SHC014 and the related RsWIV1-CoV show that these CoVs are the closest relatives to the epidemic SARS-CoV strains (Fig. 1a,b); however, there are important differences in the 14 residues that bind human ACE2, the receptor for SARS-CoV, including the five that are critical for host range: Y442, L472, N479, T487 and Y491 (ref. 7). In WIV1, three of these residues vary from the epidemic SARS-CoV Urbani strain, but they were not expected to alter binding to ACE2 (Supplementary Fig. 1a,b and Supplementary Table 1). This fact is confirmed by both pseudotyping experiments that measured the ability of lentiviruses encoding WIV1 spike proteins to enter cells expressing human ACE2 (Supplementary Fig. 1) and by in vitro replication assays of WIV1-CoV (ref. 1). In contrast, 7 of 14 ACE2-interaction residues in SHC014 are different from those in SARS-CoV, including all five residues critical for host range (Supplementary Fig. 1c and Supplementary Table 1). These changes, coupled with the failure of pseudotyped lentiviruses expressing the SHC014 spike to enter cells (Supplementary Fig. 1d), suggested that the SHC014 spike is unable to bind human ACE2. However, similar changes in related SARS-CoV strains had been reported to allow ACE2 binding7,8, suggesting that additional functional testing was required for verification. Therefore, we synthesized the SHC014 spike in the context of the replication-competent, mouse-adapted SARS-CoV backbone (we hereafter refer to the chimeric CoV as SHC014-MA15) to maximize the opportunity for pathogenesis and vaccine studies in mice (Supplementary Fig. 2a). Despite predictions from both structure-based modeling and pseudotyping experiments, SHC014-MA15 was viable and replicated to high titers in Vero cells (Supplementary Fig. 2b). Similarly to SARS, SHC014-MA15 also required a functional ACE2 molecule for entry and could use human, civet and bat ACE2 orthologs (Supplementary Fig. 2c,d). To test the ability of the SHC014 spike to mediate infection of the human airway, we examined the sensitivity of the human epithelial airway cell line Calu-3 2B4 (ref. 9) to infection and found robust SHC014-MA15 replication, comparable to that of SARS-CoV Urbani (Fig. 1c). To extend these findings, primary human airway epithelial (HAE) cultures were infected and showed robust replication of both viruses (Fig. 1d). Together, the data confirm the ability of viruses with the SHC014 spike to infect human airway cells and underscore the potential threat of cross-species transmission of SHC014-CoV. ...")

Дмитрий Воробьевский (Россия)   28.03.2020 10:57

Здравствуйте! Постепенно вроде бы проясняется источник нынешней "пандемии коронавируса". Окончательно выяснилось, что именно в городе Ухани (где всё это началось) расположен главный китайский Институт Вирусологии -- с лабораториями, предназначенными для "изучения", как говорится, "особо опасных инфекций"...

Кроме того, несмотря на нынешний временный спад экономики, именно власти Китая -- как, впрочем, и других диктаторских государств (включая Россию, увы) -- являются, очевидно, главными, так сказать, выгодо-приобретателями от нынешней пандемии, поскольку именно диктаторские режимы, наиболее приспособленные для всевозможных запретов и репрессий, теперь -- в нынешних условиях -- получили вроде бы очевидные преимущества перед более-менее демократическими и либеральными странами (хотя в нормальных условиях диктатуры, как известно, всегда проигрывают экономическое соревнование либеральным демократиям)...

Впрочем, конечно, нельзя пока полностью исключить и вероятность случайной "утечки" коронавируса из вышеупомянутого уханьского Института Вирусологии... Как, впрочем, нельзя исключить и вероятность того, что, так сказать, "интернациональную помощь" своим, как говорится, "китайским товарищам" вполне могли оказать в этом деле и представители путинского режима, имеющие большой опыт в осуществлении всевозможных "спецопераций" не только в России, но и в зарубежных странах...

В качестве дополнения прилагаю пару ссылок на один из своих предыдущих "постов" по данной теме:
https://www.facebook.com/dimvds/posts/2893477207365328 , https://ok.ru/profile/285190372887/statuses/151369700068631 .

Всем читателям -- всего самого хорошего!
Дмитрий Воробьевский, редактор самиздатской газеты "Крамола" (её блог: http://krrramola.livejournal.com/ ), г.Воронеж.

Дмитрий Воробьевский (Россия)   03.04.2020 01:45

Здравствуйте! Постепенно вроде бы проясняется источник нынешней "пандемии коронавируса". Окончательно выяснилось, что именно в городе Ухани (где всё это началось) расположен главный китайский Институт Вирусологии -- с лабораториями, предназначенными для "изучения", как говорится, "особо опасных инфекций"...

Кроме того, несмотря на нынешний временный спад экономики, именно власти Китая -- как, впрочем, и других диктаторских государств (включая Россию, увы) -- являются, очевидно, главными, так сказать, выгодо-приобретателями от нынешней пандемии, поскольку именно диктаторские режимы, наиболее приспособленные для всевозможных запретов и репрессий, теперь -- в нынешних условиях -- получили вроде бы очевидные преимущества перед более-менее демократическими и либеральными странами (хотя в нормальных условиях диктатуры, как известно, всегда проигрывают экономическое соревнование либеральным демократиям)...

Впрочем, конечно, нельзя пока полностью исключить и вероятность случайной "утечки" коронавируса из вышеупомянутого уханьского Института Вирусологии... Как, впрочем, нельзя исключить и вероятность того, что, так сказать, "интернациональную помощь" своим, как говорится, "китайским товарищам" вполне могли оказать в этом деле и представители путинского режима, имеющие большой опыт в осуществлении всевозможных "спецопераций" не только в России, но и в зарубежных странах...

И ещё добавлю, что нынешняя всемирная так называемая "борьба с коронавирусом", очень похожая то ли на эпидемию истерии и шизофрении, то ли на приучение народов к тоталитаризму, на мой взгляд, -- гораздо опаснее не только для экономики, но и вообще для человечества, чем сам этот коронавирус (вроде бы не очень сильно отличающийся по своей опасности от обычного гриппа)...

В качестве дополнения прилагаю ссылку на свою довольно старую небольшую статью "Не рукотворен ли китайский "коронавирус"?" -- http://maxpark.com/user/814874022/content/7011960 -- и пару ссылок на один из своих предыдущих "постов" по данной теме, а в самом конце -- и весь текст того "поста":
https://www.facebook.com/dimvds/posts/2893477207365328 , https://ok.ru/profile/285190372887/statuses/151369700068631 .

Всем читателям -- всего самого хорошего!
Дмитрий Воробьевский, редактор самиздатской газеты "Крамола" (её блог: http://krrramola.livejournal.com/ ), г.Воронеж.

P.S. Пара ссылок на материалы об упомянутом здесь Уханьском "Институте вирусологии Китайской академии наук" -- https://ria.ru/20200219/1564981186.html , https://ru.wikipedia.org/wiki/Уханьский_институт_вирусологии .

_________________________
____________________
________________



https://www.nature.com/articles/nm.3985 (Машинный перевод англоязычной научной статьи 2015 года об искусственной трансформации коронавируса летучих мышей в коронавирус, пригодный для того, чтобы вызвать эпидемию или даже пандемию среди людей. Согласно имеющимся данным, эти научные исследования были начаты в США, однако затем признаны незаконными, и их финансирование там было прекращено, в связи с чем они были продолжены в Институте вирусологии Китайской академии наук, в городе Ухани, где и началась нынешняя пандемия. Ссылка на комментарий в Фейсбуке, где можно прочитать о некоторых подробностях по данной теме -- https://www.facebook.com/dimvds/posts/2892204627492586?comment_id=2892258447487204 . Сначала прилагаю короткую цитату из этой статьи, а затем и её текст.):

"...Чтобы расширить эти данные, первичные культуры эпителия дыхательных путей человека (HAE) были инфицированы и показали надежную репликацию обоих вирусов (рис. 1d). Вместе эти данные подтверждают способность вирусов со Спайком SHC014 заражать клетки дыхательных путей человека и подчеркивают потенциальную угрозу межвидовой передачи SHC014-CoV. ..."
________________


"Опубликовано: 09 Ноября 2015 Г.
Похожий на торс кластер циркулирующих коронавирусов летучих мышей показывает потенциал для появления человека
Винеет Д Menachery, Бойд Л Янт Младший, Кари Debbink, Судхакар Agnihothram, Лиза Электронная Gralinski, Джессика В Планте, Рейчел L Грэм, Тревор Скоби, Син-Йи Ге, Эрик Ф Дональдсон, Ч Скотт Рэнделл, Антонио Lanzavecchia, Уэйн В Мараски, Zhengli-Ли Ши & Ральфа Барич
Nature Medicine volume 21, pages1508-1513 (2015)цитируйте эту статью

1.11 м подъезды

94 цитаты

6249 Altmetric

Metricsdetails

Исправление к этой статье было опубликовано 06 апреля 2016 года
Эта статья была обновлена
Абстрактный
Появление коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (торс-ков) и ближневосточного респираторного синдрома (БВРС)-КоВ подчеркивает угрозу межвидовой передачи событий, приводящих к вспышкам заболевания у людей. Здесь мы исследуем потенциал заболевания вирусом, похожим на торс, SHC014-CoV, который в настоящее время циркулирует в популяциях китайских подковообразных летучих мышей1. Используя систему обратной генетики SARS-Cov2, мы сгенерировали и охарактеризовали химерный вирус, экспрессирующий Спайк коронавируса летучих мышей SHC014 в адаптированном к мышам позвоночнике SARS-CoV. Полученные результаты показывают, что вирусы группы 2b, кодирующие Спайк SHC014 в позвоночнике дикого типа, могут эффективно использовать множественные ортологи рецептора атипичного ангиотензинпревращающего фермента человека II (ACE2), эффективно реплицироваться в первичных клетках дыхательных путей человека и достигать титров in vitro, эквивалентных эпидемическим штаммам атипичной пневмонии. Кроме того, эксперименты in vivo демонстрируют репликацию химерного вируса в легких мыши с заметным патогенезом. Оценка имеющихся иммунотерапевтических и профилактических методов лечения ОРВИ показала их низкую эффективность; как моноклональные антитела, так и вакцинальные подходы не смогли нейтрализовать и защитить от инфекции ков с использованием нового спайкового белка. На основании этих результатов мы синтетически воссоздали инфекционный полноразмерный рекомбинантный вирус SHC014 и продемонстрировали надежную вирусную репликацию как in vitro, так и in vivo. Наша работа предполагает потенциальный риск повторного возникновения торс-ков от вирусов, циркулирующих в настоящее время в популяциях летучих мышей.

Главный
Появление торс-ков ознаменовало собой новую эру в межвидовой передаче тяжелых респираторных заболеваний с глобализацией, ведущей к быстрому распространению по всему миру и массовым экономическим последствиям 3, 4. С тех пор несколько штаммов—включая штаммы гриппа А H5N1, H1N1 и H7N9 и БВРС-КоВ—появились в популяциях животных, вызывая значительные заболевания, смертность и экономические трудности для пострадавших регионов5. Хотя меры общественного здравоохранения смогли остановить вспышку атипичной пневмонии ков 4, недавние метагеномические исследования выявили последовательности тесно связанных с атипичной пневмонией вирусов,циркулирующих в китайских популяциях летучих мышей, которые могут представлять будущую угрозу1, 6. Однако только данные о последовательностях дают минимальную информацию для идентификации и подготовки к будущим препандемным вирусам. Поэтому, чтобы изучить потенциал возникновения (то есть потенциал заражения человека) циркулирующих ков летучих мышей, мы построили химерный вирус, кодирующий новый зоонозный ков—спайковый белок-из последовательности RsSHC014—ков, которая была выделена из китайских подковообразных летучих мышей1-в контексте адаптированного к атипичной пневмонии костяка мыши. Гибридный вирус позволил нам оценить способность нового спайкового белка вызывать заболевание независимо от других необходимых адаптивных мутаций в его естественном костяке. Используя этот подход, мы охарактеризовали ков-инфекцию, опосредованную спайковым белком SHC014 в первичных клетках дыхательных путей человека и in vivo, и проверили эффективность доступных иммунотерапевтических средств против SHC014-ков. Вместе эта стратегия преобразует данные метагеномики, чтобы помочь предсказать и подготовиться к будущим появлениям вирусов.

Последовательности SHC014 и связанного с ними RsWIV1-CoV показывают, что эти ков являются ближайшими родственниками эпидемических штаммов SARS-CoV (рис. 1a, b); однако существуют важные различия в 14 остатках, которые связывают человеческий ACE2, рецептор для SARS-CoV, включая пять, которые являются критическими для диапазона хозяина: Y442, L472, N479, T487 и Y491 (ref. 7). В WIV1 три из этих остатков отличаются от эпидемического штамма SARS-CoV Urbani, но они, как ожидалось, не изменят связывание с ACE2 (дополнительный рис. 1а, в и дополнительная таблица 1). Этот факт подтверждается обоими экспериментами по псевдотипированию, которые измеряли способность лентивирусов, кодирующих спайковые белки WIV1, проникать в клетки, экспрессирующие человеческий ACE2 (дополнительный рис. 1) и анализами репликации in vitro WIV1-CoV (ref. 1). Напротив, 7 из 14 остатков ACE2-взаимодействия в SHC014 отличаются от таковых в SARS-CoV, включая все пять остатков, критичных для диапазона хостов (дополнительный рис. 1С и дополнительная таблица 1). Эти изменения вкупе с неспособностью псевдотипированных лентивирусов, экспрессирующих Спайк SHC014, проникать в клетки (дополнительный фиг. 1d), предположил, что Спайк SHC014 не способен связывать человеческий ACE2. Однако было сообщено,что аналогичные изменения в родственных штаммах SARS-CoV позволяют связывать ACE27, 8, что предполагает необходимость дополнительного функционального тестирования для верификации. Поэтому мы синтезировали Спайк SHC014 в контексте реплицирующе-компетентного, адаптированного к мышам костяка SARS-CoV (далее мы будем называть химерный ков SHC014-MA15), чтобы максимизировать возможности для изучения патогенеза и вакцинации у мышей (дополнительный рис. 2а). Несмотря на предсказания как структурного моделирования, так и экспериментов по псевдотипированию, SHC014-MA15 был жизнеспособным и реплицировался до высоких титров в клетках Vero (дополнительный рис. 2b). Подобно атипичной пневмонии, SHC014-MA15 также требовал функциональной молекулы ACE2 для входа и мог использовать ортологи ACE2 человека, циветты и летучей мыши (дополнительный рис. 2С, г). Чтобы проверить способность шипа SHC014 опосредовать инфекцию дыхательных путей человека, мы исследовали чувствительность клеточной линии эпителиальных дыхательных путей человека Calu-3 2B4 (ref. 9) к инфекции и обнаружена устойчивая репликация SHC014-MA15, сравнимая с таковой при ОРВИ-ков Урбани (рис. 1С). Чтобы расширить эти данные, первичные культуры эпителия дыхательных путей человека (HAE) были инфицированы и показали надежную репликацию обоих вирусов (рис. 1d). Вместе эти данные подтверждают способность вирусов со Спайком SHC014 заражать клетки дыхательных путей человека и подчеркивают потенциальную угрозу межвидовой передачи SHC014-CoV.


Рис. 1: атипичные вирусы размножаются в клетках дыхательных путей человека и продуцируют патогенез in vivo.
Рисунок 1
а) полнометражные геномные последовательности репрезентативных ков были выровнены и филогенетически нанесены на карту, как описано в онлайновых методах. Шкала шкалы представляет собой нуклеотидные замены, причем маркируется только поддержка bootstrap выше 70%. Дерево показывает ков, разделенных на три различные филогенетические группы, определенные как α-ков, β-ков и γ-ков. Классические кластеры подгрупп обозначаются как 2a, 2b, 2c и 2d для β-ков и как 1a и 1b для α-ков. (b) аминокислотные последовательности доменов S1 спайков репрезентативных β-ков группы 2b, включая SARS-ков, были выровнены и филогенетически картированы. Шкала весов представляет собой аминокислотные замены. (С,D) репликацию вирусов SARS-коронавирус Урбани (черный) и SHC014-МА15 (зеленый) после заражения культуры клеток 3 2В4 (С) или высокодифференцированными, первичный воздух-жидкость Хэ клеточных культур (Д) при множественности заражения (МВД) в размере 0,01 для обоих типов клеток. Образцы были собраны в отдельные моменты времени с биологическими репликами (n = 3) как для экспериментов Calu-3, так и для экспериментов HAE. (e,f) потеря веса (n = 9 для SARS-CoV MA15; n = 16 для SHC014-MA15) (e) и репликация вируса в легких (n = 3 для SARS-CoV MA15; n = 4 для SHC014-MA15) (f) 10-недельных мышей BALB/c, инфицированных 1 × 104 p.F.u. мышей, адаптированных к SARS-CoV MA15 (черный) или SHC014-MA15 (зеленый) через интраназальный (i.n.) путь. (g,h) показаны репрезентативные изображения срезов легких, окрашенных на антиген SARS-CoV N от мышей, инфицированных SARS-CoV MA15 (n = 3 мыши) (g) или SHC014-MA15 (n = 4 мыши) (h). Для каждого графика центральное значение представляет среднее значение группы, а полосы ошибок определяют шкалу s.e.m., равную 1 мм.

Полноразмерное изображение
Чтобы оценить роль Спайка SHC014 в опосредовании инфекции in vivo, мы заразили 10-недельных мышей BALB/c 104 бляшкообразующими единицами (p. f. u.) либо SARS-MA15, либо SHC014-MA15 (рис. 1e-h). Животные, инфицированные SARS-MA15, испытывали быструю потерю веса и летальность при 4-дневной постинфекции (d. p. i.); напротив, инфекция SHC014-MA15 приводила к существенной потере веса (10%), но не летальности у мышей (рис. 1е). Исследование вирусной репликации выявило почти эквивалентные вирусные титры из легких мышей, инфицированных SARS-MA15 или SHC014-MA15 (рис. 1f). В то время как легкие у мышей, инфицированных SARS-MA15, показали сильное окрашивание как в терминальных бронхиолах, так и в легочной паренхиме 2 d.p.i. (рис. 1g), у мышей, инфицированных SHC014-MA15, наблюдалось снижение окрашивания антигеном дыхательных путей (рис. 1Н); напротив, в паренхиме или в общей гистологической картине не наблюдалось дефицита антигенного окрашивания, что свидетельствует о дифференциальной инфекции легочной ткани для SHC014-MA15 (дополнительная таблица 2). Затем мы проанализировали инфекцию у более восприимчивых животных в возрасте 12 месяцев. Зараженные SARS-MA15 животные быстро теряли вес и поддавались инфекции (дополнительный рис. 3а, б). Инфекция SHC014-MA15 индуцировала устойчивую и устойчивую потерю веса, но имела минимальную летальность. Тенденции в гистологическом и антигенном окрашивании образцов, которые мы наблюдали у молодых мышей, были сохранены у более старых животных (дополнительная таблица 3). Мы исключили возможность того, что SHC014-MA15 был опосредован инфекцией через альтернативный рецептор на основе экспериментов с использованием Ace2−/− мышей, которые не показали потери веса или окрашивания антигеном после инфекции SHC014-MA15 (дополнительный рис. 4а, В и дополнительная таблица 2). Вместе взятые данные указывают на то, что вирусы со Спайком SHC014 способны индуцировать потерю веса у мышей в условиях вирулентного Ковенанта.

Учитывая доклиническую эффективность терапии моноклональными антителами к Эболе, например ZMApp10, мы затем попытались определить эффективность моноклональных антител к атипичной пневмонии против инфекции SHC014-MA15. Ранее сообщалось о четырех широко нейтрализующих человеческих моноклональных антителах, нацеленных на спайковый белок SARS-CoV, которые являются вероятными реагентами для иммунотерапии 11, 12, 13. Мы изучили влияние этих антител на вирусную репликацию (выраженное в процентном ингибировании вирусной репликации) и обнаружили, что в то время как атипичная пневмония дикого типа была сильно нейтрализована всеми четырьмя антителами при относительно низких концентрациях антител (Рис.1). 2a-d), нейтрализация варьировалась для SHC014-MA15. Fm6, антитело, генерируемое фагом display и escape-мутантами 11, 12, достигало только фоновых уровней ингибирования репликации SHC014-MA15 (рис. 2а). Аналогичным образом, антитела 230.15 и 227.14, которые были получены из клеток памяти в инфицированных SARS-CoV пациентах13, также не смогли блокировать репликацию SHC014-MA15 (рис. 2b, c). Для всех трех антител различия между спайковыми аминокислотными последовательностями SARS и SHC014 соответствовали прямым или смежным изменениям остатков, обнаруженным у побеговых мутантов SARS-CoV (fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q/E), что, вероятно, объясняет отсутствие нейтрализующей активности антител против SHC014. Наконец, моноклональное антитело 109.8 смогло достичь 50% нейтрализации SHC014-MA15, но только при высоких концентрациях (10 мкг / мл) (Рис.1). 2d). Вместе взятые результаты показывают, что широко нейтрализующие антитела против SARS-CoV могут иметь лишь незначительную эффективность против эмерджентных SARS-подобных штаммов CoV, таких как SHC014.

Рис. 2: моноклональные антитела к атипичной пневмонии имеют предельную эффективность в отношении атипичной пневмонии.
Рисунок 2
(a-d) анализы нейтрализации, оценивающие эффективность (измеряемую как уменьшение количества бляшек) панели моноклональных антител, которые все были первоначально сгенерированы против эпидемии SARS-CoV, против инфицирования клеток Vero SARS-CoV Urbani (черный) или SHC014-MA15 (зеленый). Тестируемые антитела были fm6 (n = 3 для Urbani; n = 5 для SHC014-MA15) 11,12 (a), 230,15 (n = 3 для Urbani; n = 2 для SHC014-MA15) (b), 227,15 (n = 3 для Urbani; n = 5 для SHC014-MA15) (c)и 109,8 (n = 3 для Urbani; n = 2 для SHC014-MA15) 13 (d). Каждая точка данных представляет собой среднее значение группы, а полосы ошибок определяют s. e. m.обратите внимание,что полосы ошибок в зараженных SARS-CoV Urbani клетках Vero в b, c перекрываются символами и не видны.

Полноразмерное изображение
Для оценки эффективности существующих вакцин против инфекции SHC014-MA15 мы вакцинировали пожилых мышей двукратно инактивированным цельным SARS-CoV (DIV). Предыдущие работы показали, что DIV может нейтрализовать и защитить молодых мышей от вызова с гомологичным вирусом14; однако вакцина не смогла защитить пожилых животных, у которых также наблюдалась усиленная иммунная патология, что указывает на возможность причинения животным вреда из-за вакцинации15. Здесь мы обнаружили, что DIV не обеспечивает защиту от вызова с SHC014-MA15 в отношении потери веса или вирусного титра (дополнительный рис. 5а, б). В соответствии с предыдущим сообщением с другими гетерологичными группами 2b CoVs15, сыворотка от DIV-вакцинированных пожилых мышей также не смогла нейтрализовать SHC014-MA15 (дополнительный рис. 5С). Примечательно, что вакцинация DIV приводила к стойкой иммунной патологии (дополнительная таблица 4) и эозинофилии (дополнительный рис. 5d-f). В совокупности эти результаты подтверждают, что вакцина DIV не будет защищать от инфекции SHC014 и, возможно, может усилить заболевание в пожилой вакцинированной группе.

В отличие от вакцинации мышей с DIV, использование SHC014-MA15 в качестве живой аттенуированной вакцины показало потенциальную перекрестную защиту от инфекции с SARS-CoV, но результаты имеют важные предостережения. Мы заразили молодых мышей 104 p. f. u. SHC014-MA15 и наблюдали их в течение 28 дней.затем мы бросили вызов мышам с SARS-MA15 на 29-й день (дополнительный рис. 6а). Предшествующее заражение мышей высокой дозой SHC014-MA15 обеспечивало защиту от вызова с летальной дозой SARS-MA15, хотя была только минимальная реакция нейтрализации SARS-CoV от антисыворотки, вызванной через 28 дней после заражения SHC014-MA15 (дополнительный рис. 6b, 1: 200). При отсутствии вторичного усиления антигена 28 d. p. i. представляет собой ожидаемый пик титров антител и подразумевает,что со временем будет снижена защита от SARS-ков 16, 17. Аналогичные результаты, свидетельствующие о защите от вызова с летальной дозой SARS-CoV, наблюдались у пожилых мышей BALB/c в отношении потери веса и репликации вируса (дополнительный рис. 6С, г). Однако инфекционная доза SHC014-MA15 в дозе 104 р. У. Е. индуцировала > 10% - ную потерю веса и летальность у некоторых пожилых животных (рис. 1 и дополнительный рис. 3). Мы обнаружили, что вакцинация с более низкой дозой SHC014-MA15 (100 p.f. u.) не вызывала потери веса, но также не смогла защитить пожилых животных от смертельной дозы SARS-MA15 (дополнительный рис. 6е, f). Вместе взятые данные свидетельствуют о том, что shc014-MA15 challenge может обеспечить перекрестную защиту от торс-ков с помощью консервированных эпитопов, но требуемая доза индуцирует патогенез и исключает использование в качестве аттенуированной вакцины.

Установив, что Спайк SHC014 обладает способностью опосредовать инфицирование клеток человека и вызывать заболевание у мышей, мы затем синтезировали полноразмерный инфекционный клон SHC014-CoV на основе подхода, используемого для SARS-CoV (рис. 3а) 2. Репликация в клетках Vero не выявила дефицита SHC014-CoV по сравнению с таковым для SARS-CoV (рис. 3b); однако SHC014-CoV был значительно (Р < 0,01) ослаблен в первичных культурах HAE как через 24, так и через 48 ч после заражения (рис. 3С). In vivo инфицирование мышей не продемонстрировало значимой потери веса, но продемонстрировало снижение вирусной репликации в легких при полноразмерной инфекции SHC014-CoV, по сравнению с SARS-CoV Urbani (рис. 3d, e). Вместе взятые результаты подтверждают жизнеспособность полноразмерного SHC014-CoV, но предполагают, что для его репликации требуется дальнейшая адаптация, эквивалентная репликации эпидемического SARS-CoV в респираторных клетках человека и мышей.

Рис. 3: полноразмерный SHC014-CoV реплицируется в дыхательных путях человека, но не обладает вирулентностью эпидемии SARS-CoV."

____________________________
_________________________



(Текст -- точнее, начало текста -- оригинала данной статьи на английском языке:
"Letter
Published: 09 November 2015
A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence
Vineet D Menachery, Boyd L Yount Jr, Kari Debbink, Sudhakar Agnihothram, Lisa E Gralinski, Jessica A Plante, Rachel L Graham, Trevor Scobey, Xing-Yi Ge, Eric F Donaldson, Scott H Randell, Antonio Lanzavecchia, Wayne A Marasco, Zhengli-Li Shi & Ralph S Baric
Nature Medicine volume 21, pages1508–1513(2015)Cite this article

1.11m Accesses

94 Citations

6249 Altmetric

Metricsdetails

A Corrigendum to this article was published on 06 April 2016
This article has been updated
Abstract
The emergence of severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) and Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV underscores the threat of cross-species transmission events leading to outbreaks in humans. Here we examine the disease potential of a SARS-like virus, SHC014-CoV, which is currently circulating in Chinese horseshoe bat populations1. Using the SARS-CoV reverse genetics system2, we generated and characterized a chimeric virus expressing the spike of bat coronavirus SHC014 in a mouse-adapted SARS-CoV backbone. The results indicate that group 2b viruses encoding the SHC014 spike in a wild-type backbone can efficiently use multiple orthologs of the SARS receptor human angiotensin converting enzyme II (ACE2), replicate efficiently in primary human airway cells and achieve in vitro titers equivalent to epidemic strains of SARS-CoV. Additionally, in vivo experiments demonstrate replication of the chimeric virus in mouse lung with notable pathogenesis. Evaluation of available SARS-based immune-therapeutic and prophylactic modalities revealed poor efficacy; both monoclonal antibody and vaccine approaches failed to neutralize and protect from infection with CoVs using the novel spike protein. On the basis of these findings, we synthetically re-derived an infectious full-length SHC014 recombinant virus and demonstrate robust viral replication both in vitro and in vivo. Our work suggests a potential risk of SARS-CoV re-emergence from viruses currently circulating in bat populations.

Main
The emergence of SARS-CoV heralded a new era in the cross-species transmission of severe respiratory illness with globalization leading to rapid spread around the world and massive economic impact3,4. Since then, several strains—including influenza A strains H5N1, H1N1 and H7N9 and MERS-CoV—have emerged from animal populations, causing considerable disease, mortality and economic hardship for the afflicted regions5. Although public health measures were able to stop the SARS-CoV outbreak4, recent metagenomics studies have identified sequences of closely related SARS-like viruses circulating in Chinese bat populations that may pose a future threat1,6. However, sequence data alone provides minimal insights to identify and prepare for future prepandemic viruses. Therefore, to examine the emergence potential (that is, the potential to infect humans) of circulating bat CoVs, we built a chimeric virus encoding a novel, zoonotic CoV spike protein—from the RsSHC014-CoV sequence that was isolated from Chinese horseshoe bats1—in the context of the SARS-CoV mouse-adapted backbone. The hybrid virus allowed us to evaluate the ability of the novel spike protein to cause disease independently of other necessary adaptive mutations in its natural backbone. Using this approach, we characterized CoV infection mediated by the SHC014 spike protein in primary human airway cells and in vivo, and tested the efficacy of available immune therapeutics against SHC014-CoV. Together, the strategy translates metagenomics data to help predict and prepare for future emergent viruses.

The sequences of SHC014 and the related RsWIV1-CoV show that these CoVs are the closest relatives to the epidemic SARS-CoV strains (Fig. 1a,b); however, there are important differences in the 14 residues that bind human ACE2, the receptor for SARS-CoV, including the five that are critical for host range: Y442, L472, N479, T487 and Y491 (ref. 7). In WIV1, three of these residues vary from the epidemic SARS-CoV Urbani strain, but they were not expected to alter binding to ACE2 (Supplementary Fig. 1a,b and Supplementary Table 1). This fact is confirmed by both pseudotyping experiments that measured the ability of lentiviruses encoding WIV1 spike proteins to enter cells expressing human ACE2 (Supplementary Fig. 1) and by in vitro replication assays of WIV1-CoV (ref. 1). In contrast, 7 of 14 ACE2-interaction residues in SHC014 are different from those in SARS-CoV, including all five residues critical for host range (Supplementary Fig. 1c and Supplementary Table 1). These changes, coupled with the failure of pseudotyped lentiviruses expressing the SHC014 spike to enter cells (Supplementary Fig. 1d), suggested that the SHC014 spike is unable to bind human ACE2. However, similar changes in related SARS-CoV strains had been reported to allow ACE2 binding7,8, suggesting that additional functional testing was required for verification. Therefore, we synthesized the SHC014 spike in the context of the replication-competent, mouse-adapted SARS-CoV backbone (we hereafter refer to the chimeric CoV as SHC014-MA15) to maximize the opportunity for pathogenesis and vaccine studies in mice (Supplementary Fig. 2a). Despite predictions from both structure-based modeling and pseudotyping experiments, SHC014-MA15 was viable and replicated to high titers in Vero cells (Supplementary Fig. 2b). Similarly to SARS, SHC014-MA15 also required a functional ACE2 molecule for entry and could use human, civet and bat ACE2 orthologs (Supplementary Fig. 2c,d). To test the ability of the SHC014 spike to mediate infection of the human airway, we examined the sensitivity of the human epithelial airway cell line Calu-3 2B4 (ref. 9) to infection and found robust SHC014-MA15 replication, comparable to that of SARS-CoV Urbani (Fig. 1c). To extend these findings, primary human airway epithelial (HAE) cultures were infected and showed robust replication of both viruses (Fig. 1d). Together, the data confirm the ability of viruses with the SHC014 spike to infect human airway cells and underscore the potential threat of cross-species transmission of SHC014-CoV. ...")

Дмитрий Воробьевский (Россия)   03.04.2020 01:50

Здравствуйте! Извиняюсь за повтор этого своего комментария (где-то в "Кругозоре" я его уже поставил)... Постепенно вроде бы проясняется источник нынешней "пандемии коронавируса". Окончательно выяснилось, что именно в городе Ухани (где всё это началось) расположен главный китайский Институт Вирусологии -- с лабораториями, предназначенными для "изучения", как говорится, "особо опасных инфекций"...

Кроме того, несмотря на нынешний временный спад экономики, именно власти Китая -- как, впрочем, и других диктаторских государств (включая Россию, увы) -- являются, очевидно, главными, так сказать, выгодо-приобретателями от нынешней пандемии, поскольку именно диктаторские режимы, наиболее приспособленные для всевозможных запретов и репрессий, теперь -- в нынешних условиях -- получили вроде бы очевидные преимущества перед более-менее демократическими и либеральными странами (хотя в нормальных условиях диктатуры, как известно, всегда проигрывают экономическое соревнование либеральным демократиям)...

Впрочем, конечно, нельзя пока полностью исключить и вероятность случайной "утечки" коронавируса из вышеупомянутого уханьского Института Вирусологии... Как, впрочем, нельзя исключить и вероятность того, что, так сказать, "интернациональную помощь" своим, как говорится, "китайским товарищам" вполне могли оказать в этом деле и представители путинского режима, имеющие большой опыт в осуществлении всевозможных "спецопераций" не только в России, но и в зарубежных странах...

И ещё добавлю, что нынешняя всемирная так называемая "борьба с коронавирусом", очень похожая то ли на эпидемию истерии и шизофрении, то ли на приучение народов к тоталитаризму, на мой взгляд, -- гораздо опаснее не только для экономики, но и вообще для человечества, чем сам этот коронавирус (вроде бы не очень сильно отличающийся по своей опасности от обычного гриппа)...

В качестве дополнения прилагаю ссылку на свою довольно старую небольшую статью "Не рукотворен ли китайский "коронавирус"?" -- http://maxpark.com/user/814874022/content/7011960 -- и пару ссылок на один из своих предыдущих "постов" по данной теме, а в самом конце -- и весь текст того "поста":
https://www.facebook.com/dimvds/posts/2893477207365328 , https://ok.ru/profile/285190372887/statuses/151369700068631 .

Всем читателям -- всего самого хорошего!
Дмитрий Воробьевский, редактор самиздатской газеты "Крамола" (её блог: http://krrramola.livejournal.com/ ), г.Воронеж.

P.S. Пара ссылок на материалы об упомянутом здесь Уханьском "Институте вирусологии Китайской академии наук" -- https://ria.ru/20200219/1564981186.html , https://ru.wikipedia.org/wiki/Уханьский_институт_вирусологии .

_________________________
____________________
________________



https://www.nature.com/articles/nm.3985 (Машинный перевод англоязычной научной статьи 2015 года об искусственной трансформации коронавируса летучих мышей в коронавирус, пригодный для того, чтобы вызвать эпидемию или даже пандемию среди людей. Согласно имеющимся данным, эти научные исследования были начаты в США, однако затем признаны незаконными, и их финансирование там было прекращено, в связи с чем они были продолжены в Институте вирусологии Китайской академии наук, в городе Ухани, где и началась нынешняя пандемия. Ссылка на комментарий в Фейсбуке, где можно прочитать о некоторых подробностях по данной теме -- https://www.facebook.com/dimvds/posts/2892204627492586?comment_id=2892258447487204 . Сначала прилагаю короткую цитату из этой статьи, а затем и её текст.):

"...Чтобы расширить эти данные, первичные культуры эпителия дыхательных путей человека (HAE) были инфицированы и показали надежную репликацию обоих вирусов (рис. 1d). Вместе эти данные подтверждают способность вирусов со Спайком SHC014 заражать клетки дыхательных путей человека и подчеркивают потенциальную угрозу межвидовой передачи SHC014-CoV. ..."
________________


"Опубликовано: 09 Ноября 2015 Г.
Похожий на торс кластер циркулирующих коронавирусов летучих мышей показывает потенциал для появления человека
Винеет Д Menachery, Бойд Л Янт Младший, Кари Debbink, Судхакар Agnihothram, Лиза Электронная Gralinski, Джессика В Планте, Рейчел L Грэм, Тревор Скоби, Син-Йи Ге, Эрик Ф Дональдсон, Ч Скотт Рэнделл, Антонио Lanzavecchia, Уэйн В Мараски, Zhengli-Ли Ши & Ральфа Барич
Nature Medicine volume 21, pages1508-1513 (2015)цитируйте эту статью

1.11 м подъезды

94 цитаты

6249 Altmetric

Metricsdetails

Исправление к этой статье было опубликовано 06 апреля 2016 года
Эта статья была обновлена
Абстрактный
Появление коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (торс-ков) и ближневосточного респираторного синдрома (БВРС)-КоВ подчеркивает угрозу межвидовой передачи событий, приводящих к вспышкам заболевания у людей. Здесь мы исследуем потенциал заболевания вирусом, похожим на торс, SHC014-CoV, который в настоящее время циркулирует в популяциях китайских подковообразных летучих мышей1. Используя систему обратной генетики SARS-Cov2, мы сгенерировали и охарактеризовали химерный вирус, экспрессирующий Спайк коронавируса летучих мышей SHC014 в адаптированном к мышам позвоночнике SARS-CoV. Полученные результаты показывают, что вирусы группы 2b, кодирующие Спайк SHC014 в позвоночнике дикого типа, могут эффективно использовать множественные ортологи рецептора атипичного ангиотензинпревращающего фермента человека II (ACE2), эффективно реплицироваться в первичных клетках дыхательных путей человека и достигать титров in vitro, эквивалентных эпидемическим штаммам атипичной пневмонии. Кроме того, эксперименты in vivo демонстрируют репликацию химерного вируса в легких мыши с заметным патогенезом. Оценка имеющихся иммунотерапевтических и профилактических методов лечения ОРВИ показала их низкую эффективность; как моноклональные антитела, так и вакцинальные подходы не смогли нейтрализовать и защитить от инфекции ков с использованием нового спайкового белка. На основании этих результатов мы синтетически воссоздали инфекционный полноразмерный рекомбинантный вирус SHC014 и продемонстрировали надежную вирусную репликацию как in vitro, так и in vivo. Наша работа предполагает потенциальный риск повторного возникновения торс-ков от вирусов, циркулирующих в настоящее время в популяциях летучих мышей.

Главный
Появление торс-ков ознаменовало собой новую эру в межвидовой передаче тяжелых респираторных заболеваний с глобализацией, ведущей к быстрому распространению по всему миру и массовым экономическим последствиям 3, 4. С тех пор несколько штаммов—включая штаммы гриппа А H5N1, H1N1 и H7N9 и БВРС-КоВ—появились в популяциях животных, вызывая значительные заболевания, смертность и экономические трудности для пострадавших регионов5. Хотя меры общественного здравоохранения смогли остановить вспышку атипичной пневмонии ков 4, недавние метагеномические исследования выявили последовательности тесно связанных с атипичной пневмонией вирусов,циркулирующих в китайских популяциях летучих мышей, которые могут представлять будущую угрозу1, 6. Однако только данные о последовательностях дают минимальную информацию для идентификации и подготовки к будущим препандемным вирусам. Поэтому, чтобы изучить потенциал возникновения (то есть потенциал заражения человека) циркулирующих ков летучих мышей, мы построили химерный вирус, кодирующий новый зоонозный ков—спайковый белок-из последовательности RsSHC014—ков, которая была выделена из китайских подковообразных летучих мышей1-в контексте адаптированного к атипичной пневмонии костяка мыши. Гибридный вирус позволил нам оценить способность нового спайкового белка вызывать заболевание независимо от других необходимых адаптивных мутаций в его естественном костяке. Используя этот подход, мы охарактеризовали ков-инфекцию, опосредованную спайковым белком SHC014 в первичных клетках дыхательных путей человека и in vivo, и проверили эффективность доступных иммунотерапевтических средств против SHC014-ков. Вместе эта стратегия преобразует данные метагеномики, чтобы помочь предсказать и подготовиться к будущим появлениям вирусов.

Последовательности SHC014 и связанного с ними RsWIV1-CoV показывают, что эти ков являются ближайшими родственниками эпидемических штаммов SARS-CoV (рис. 1a, b); однако существуют важные различия в 14 остатках, которые связывают человеческий ACE2, рецептор для SARS-CoV, включая пять, которые являются критическими для диапазона хозяина: Y442, L472, N479, T487 и Y491 (ref. 7). В WIV1 три из этих остатков отличаются от эпидемического штамма SARS-CoV Urbani, но они, как ожидалось, не изменят связывание с ACE2 (дополнительный рис. 1а, в и дополнительная таблица 1). Этот факт подтверждается обоими экспериментами по псевдотипированию, которые измеряли способность лентивирусов, кодирующих спайковые белки WIV1, проникать в клетки, экспрессирующие человеческий ACE2 (дополнительный рис. 1) и анализами репликации in vitro WIV1-CoV (ref. 1). Напротив, 7 из 14 остатков ACE2-взаимодействия в SHC014 отличаются от таковых в SARS-CoV, включая все пять остатков, критичных для диапазона хостов (дополнительный рис. 1С и дополнительная таблица 1). Эти изменения вкупе с неспособностью псевдотипированных лентивирусов, экспрессирующих Спайк SHC014, проникать в клетки (дополнительный фиг. 1d), предположил, что Спайк SHC014 не способен связывать человеческий ACE2. Однако было сообщено,что аналогичные изменения в родственных штаммах SARS-CoV позволяют связывать ACE27, 8, что предполагает необходимость дополнительного функционального тестирования для верификации. Поэтому мы синтезировали Спайк SHC014 в контексте реплицирующе-компетентного, адаптированного к мышам костяка SARS-CoV (далее мы будем называть химерный ков SHC014-MA15), чтобы максимизировать возможности для изучения патогенеза и вакцинации у мышей (дополнительный рис. 2а). Несмотря на предсказания как структурного моделирования, так и экспериментов по псевдотипированию, SHC014-MA15 был жизнеспособным и реплицировался до высоких титров в клетках Vero (дополнительный рис. 2b). Подобно атипичной пневмонии, SHC014-MA15 также требовал функциональной молекулы ACE2 для входа и мог использовать ортологи ACE2 человека, циветты и летучей мыши (дополнительный рис. 2С, г). Чтобы проверить способность шипа SHC014 опосредовать инфекцию дыхательных путей человека, мы исследовали чувствительность клеточной линии эпителиальных дыхательных путей человека Calu-3 2B4 (ref. 9) к инфекции и обнаружена устойчивая репликация SHC014-MA15, сравнимая с таковой при ОРВИ-ков Урбани (рис. 1С). Чтобы расширить эти данные, первичные культуры эпителия дыхательных путей человека (HAE) были инфицированы и показали надежную репликацию обоих вирусов (рис. 1d). Вместе эти данные подтверждают способность вирусов со Спайком SHC014 заражать клетки дыхательных путей человека и подчеркивают потенциальную угрозу межвидовой передачи SHC014-CoV.


Рис. 1: атипичные вирусы размножаются в клетках дыхательных путей человека и продуцируют патогенез in vivo.
Рисунок 1
а) полнометражные геномные последовательности репрезентативных ков были выровнены и филогенетически нанесены на карту, как описано в онлайновых методах. Шкала шкалы представляет собой нуклеотидные замены, причем маркируется только поддержка bootstrap выше 70%. Дерево показывает ков, разделенных на три различные филогенетические группы, определенные как α-ков, β-ков и γ-ков. Классические кластеры подгрупп обозначаются как 2a, 2b, 2c и 2d для β-ков и как 1a и 1b для α-ков. (b) аминокислотные последовательности доменов S1 спайков репрезентативных β-ков группы 2b, включая SARS-ков, были выровнены и филогенетически картированы. Шкала весов представляет собой аминокислотные замены. (С,D) репликацию вирусов SARS-коронавирус Урбани (черный) и SHC014-МА15 (зеленый) после заражения культуры клеток 3 2В4 (С) или высокодифференцированными, первичный воздух-жидкость Хэ клеточных культур (Д) при множественности заражения (МВД) в размере 0,01 для обоих типов клеток. Образцы были собраны в отдельные моменты времени с биологическими репликами (n = 3) как для экспериментов Calu-3, так и для экспериментов HAE. (e,f) потеря веса (n = 9 для SARS-CoV MA15; n = 16 для SHC014-MA15) (e) и репликация вируса в легких (n = 3 для SARS-CoV MA15; n = 4 для SHC014-MA15) (f) 10-недельных мышей BALB/c, инфицированных 1 × 104 p.F.u. мышей, адаптированных к SARS-CoV MA15 (черный) или SHC014-MA15 (зеленый) через интраназальный (i.n.) путь. (g,h) показаны репрезентативные изображения срезов легких, окрашенных на антиген SARS-CoV N от мышей, инфицированных SARS-CoV MA15 (n = 3 мыши) (g) или SHC014-MA15 (n = 4 мыши) (h). Для каждого графика центральное значение представляет среднее значение группы, а полосы ошибок определяют шкалу s.e.m., равную 1 мм.

Полноразмерное изображение
Чтобы оценить роль Спайка SHC014 в опосредовании инфекции in vivo, мы заразили 10-недельных мышей BALB/c 104 бляшкообразующими единицами (p. f. u.) либо SARS-MA15, либо SHC014-MA15 (рис. 1e-h). Животные, инфицированные SARS-MA15, испытывали быструю потерю веса и летальность при 4-дневной постинфекции (d. p. i.); напротив, инфекция SHC014-MA15 приводила к существенной потере веса (10%), но не летальности у мышей (рис. 1е). Исследование вирусной репликации выявило почти эквивалентные вирусные титры из легких мышей, инфицированных SARS-MA15 или SHC014-MA15 (рис. 1f). В то время как легкие у мышей, инфицированных SARS-MA15, показали сильное окрашивание как в терминальных бронхиолах, так и в легочной паренхиме 2 d.p.i. (рис. 1g), у мышей, инфицированных SHC014-MA15, наблюдалось снижение окрашивания антигеном дыхательных путей (рис. 1Н); напротив, в паренхиме или в общей гистологической картине не наблюдалось дефицита антигенного окрашивания, что свидетельствует о дифференциальной инфекции легочной ткани для SHC014-MA15 (дополнительная таблица 2). Затем мы проанализировали инфекцию у более восприимчивых животных в возрасте 12 месяцев. Зараженные SARS-MA15 животные быстро теряли вес и поддавались инфекции (дополнительный рис. 3а, б). Инфекция SHC014-MA15 индуцировала устойчивую и устойчивую потерю веса, но имела минимальную летальность. Тенденции в гистологическом и антигенном окрашивании образцов, которые мы наблюдали у молодых мышей, были сохранены у более старых животных (дополнительная таблица 3). Мы исключили возможность того, что SHC014-MA15 был опосредован инфекцией через альтернативный рецептор на основе экспериментов с использованием Ace2−/− мышей, которые не показали потери веса или окрашивания антигеном после инфекции SHC014-MA15 (дополнительный рис. 4а, В и дополнительная таблица 2). Вместе взятые данные указывают на то, что вирусы со Спайком SHC014 способны индуцировать потерю веса у мышей в условиях вирулентного Ковенанта.

Учитывая доклиническую эффективность терапии моноклональными антителами к Эболе, например ZMApp10, мы затем попытались определить эффективность моноклональных антител к атипичной пневмонии против инфекции SHC014-MA15. Ранее сообщалось о четырех широко нейтрализующих человеческих моноклональных антителах, нацеленных на спайковый белок SARS-CoV, которые являются вероятными реагентами для иммунотерапии 11, 12, 13. Мы изучили влияние этих антител на вирусную репликацию (выраженное в процентном ингибировании вирусной репликации) и обнаружили, что в то время как атипичная пневмония дикого типа была сильно нейтрализована всеми четырьмя антителами при относительно низких концентрациях антител (Рис.1). 2a-d), нейтрализация варьировалась для SHC014-MA15. Fm6, антитело, генерируемое фагом display и escape-мутантами 11, 12, достигало только фоновых уровней ингибирования репликации SHC014-MA15 (рис. 2а). Аналогичным образом, антитела 230.15 и 227.14, которые были получены из клеток памяти в инфицированных SARS-CoV пациентах13, также не смогли блокировать репликацию SHC014-MA15 (рис. 2b, c). Для всех трех антител различия между спайковыми аминокислотными последовательностями SARS и SHC014 соответствовали прямым или смежным изменениям остатков, обнаруженным у побеговых мутантов SARS-CoV (fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q/E), что, вероятно, объясняет отсутствие нейтрализующей активности антител против SHC014. Наконец, моноклональное антитело 109.8 смогло достичь 50% нейтрализации SHC014-MA15, но только при высоких концентрациях (10 мкг / мл) (Рис.1). 2d). Вместе взятые результаты показывают, что широко нейтрализующие антитела против SARS-CoV могут иметь лишь незначительную эффективность против эмерджентных SARS-подобных штаммов CoV, таких как SHC014.

Рис. 2: моноклональные антитела к атипичной пневмонии имеют предельную эффективность в отношении атипичной пневмонии.
Рисунок 2
(a-d) анализы нейтрализации, оценивающие эффективность (измеряемую как уменьшение количества бляшек) панели моноклональных антител, которые все были первоначально сгенерированы против эпидемии SARS-CoV, против инфицирования клеток Vero SARS-CoV Urbani (черный) или SHC014-MA15 (зеленый). Тестируемые антитела были fm6 (n = 3 для Urbani; n = 5 для SHC014-MA15) 11,12 (a), 230,15 (n = 3 для Urbani; n = 2 для SHC014-MA15) (b), 227,15 (n = 3 для Urbani; n = 5 для SHC014-MA15) (c)и 109,8 (n = 3 для Urbani; n = 2 для SHC014-MA15) 13 (d). Каждая точка данных представляет собой среднее значение группы, а полосы ошибок определяют s. e. m.обратите внимание,что полосы ошибок в зараженных SARS-CoV Urbani клетках Vero в b, c перекрываются символами и не видны.

Полноразмерное изображение
Для оценки эффективности существующих вакцин против инфекции SHC014-MA15 мы вакцинировали пожилых мышей двукратно инактивированным цельным SARS-CoV (DIV). Предыдущие работы показали, что DIV может нейтрализовать и защитить молодых мышей от вызова с гомологичным вирусом14; однако вакцина не смогла защитить пожилых животных, у которых также наблюдалась усиленная иммунная патология, что указывает на возможность причинения животным вреда из-за вакцинации15. Здесь мы обнаружили, что DIV не обеспечивает защиту от вызова с SHC014-MA15 в отношении потери веса или вирусного титра (дополнительный рис. 5а, б). В соответствии с предыдущим сообщением с другими гетерологичными группами 2b CoVs15, сыворотка от DIV-вакцинированных пожилых мышей также не смогла нейтрализовать SHC014-MA15 (дополнительный рис. 5С). Примечательно, что вакцинация DIV приводила к стойкой иммунной патологии (дополнительная таблица 4) и эозинофилии (дополнительный рис. 5d-f). В совокупности эти результаты подтверждают, что вакцина DIV не будет защищать от инфекции SHC014 и, возможно, может усилить заболевание в пожилой вакцинированной группе.

В отличие от вакцинации мышей с DIV, использование SHC014-MA15 в качестве живой аттенуированной вакцины показало потенциальную перекрестную защиту от инфекции с SARS-CoV, но результаты имеют важные предостережения. Мы заразили молодых мышей 104 p. f. u. SHC014-MA15 и наблюдали их в течение 28 дней.затем мы бросили вызов мышам с SARS-MA15 на 29-й день (дополнительный рис. 6а). Предшествующее заражение мышей высокой дозой SHC014-MA15 обеспечивало защиту от вызова с летальной дозой SARS-MA15, хотя была только минимальная реакция нейтрализации SARS-CoV от антисыворотки, вызванной через 28 дней после заражения SHC014-MA15 (дополнительный рис. 6b, 1: 200). При отсутствии вторичного усиления антигена 28 d. p. i. представляет собой ожидаемый пик титров антител и подразумевает,что со временем будет снижена защита от SARS-ков 16, 17. Аналогичные результаты, свидетельствующие о защите от вызова с летальной дозой SARS-CoV, наблюдались у пожилых мышей BALB/c в отношении потери веса и репликации вируса (дополнительный рис. 6С, г). Однако инфекционная доза SHC014-MA15 в дозе 104 р. У. Е. индуцировала > 10% - ную потерю веса и летальность у некоторых пожилых животных (рис. 1 и дополнительный рис. 3). Мы обнаружили, что вакцинация с более низкой дозой SHC014-MA15 (100 p.f. u.) не вызывала потери веса, но также не смогла защитить пожилых животных от смертельной дозы SARS-MA15 (дополнительный рис. 6е, f). Вместе взятые данные свидетельствуют о том, что shc014-MA15 challenge может обеспечить перекрестную защиту от торс-ков с помощью консервированных эпитопов, но требуемая доза индуцирует патогенез и исключает использование в качестве аттенуированной вакцины.

Установив, что Спайк SHC014 обладает способностью опосредовать инфицирование клеток человека и вызывать заболевание у мышей, мы затем синтезировали полноразмерный инфекционный клон SHC014-CoV на основе подхода, используемого для SARS-CoV (рис. 3а) 2. Репликация в клетках Vero не выявила дефицита SHC014-CoV по сравнению с таковым для SARS-CoV (рис. 3b); однако SHC014-CoV был значительно (Р < 0,01) ослаблен в первичных культурах HAE как через 24, так и через 48 ч после заражения (рис. 3С). In vivo инфицирование мышей не продемонстрировало значимой потери веса, но продемонстрировало снижение вирусной репликации в легких при полноразмерной инфекции SHC014-CoV, по сравнению с SARS-CoV Urbani (рис. 3d, e). Вместе взятые результаты подтверждают жизнеспособность полноразмерного SHC014-CoV, но предполагают, что для его репликации требуется дальнейшая адаптация, эквивалентная репликации эпидемического SARS-CoV в респираторных клетках человека и мышей.

Рис. 3: полноразмерный SHC014-CoV реплицируется в дыхательных путях человека, но не обладает вирулентностью эпидемии SARS-CoV."

____________________________
_________________________



(Текст -- точнее, начало текста -- оригинала данной статьи на английском языке:
"Letter
Published: 09 November 2015
A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence
Vineet D Menachery, Boyd L Yount Jr, Kari Debbink, Sudhakar Agnihothram, Lisa E Gralinski, Jessica A Plante, Rachel L Graham, Trevor Scobey, Xing-Yi Ge, Eric F Donaldson, Scott H Randell, Antonio Lanzavecchia, Wayne A Marasco, Zhengli-Li Shi & Ralph S Baric
Nature Medicine volume 21, pages1508–1513(2015)Cite this article

1.11m Accesses

94 Citations

6249 Altmetric

Metricsdetails

A Corrigendum to this article was published on 06 April 2016
This article has been updated
Abstract
The emergence of severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) and Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV underscores the threat of cross-species transmission events leading to outbreaks in humans. Here we examine the disease potential of a SARS-like virus, SHC014-CoV, which is currently circulating in Chinese horseshoe bat populations1. Using the SARS-CoV reverse genetics system2, we generated and characterized a chimeric virus expressing the spike of bat coronavirus SHC014 in a mouse-adapted SARS-CoV backbone. The results indicate that group 2b viruses encoding the SHC014 spike in a wild-type backbone can efficiently use multiple orthologs of the SARS receptor human angiotensin converting enzyme II (ACE2), replicate efficiently in primary human airway cells and achieve in vitro titers equivalent to epidemic strains of SARS-CoV. Additionally, in vivo experiments demonstrate replication of the chimeric virus in mouse lung with notable pathogenesis. Evaluation of available SARS-based immune-therapeutic and prophylactic modalities revealed poor efficacy; both monoclonal antibody and vaccine approaches failed to neutralize and protect from infection with CoVs using the novel spike protein. On the basis of these findings, we synthetically re-derived an infectious full-length SHC014 recombinant virus and demonstrate robust viral replication both in vitro and in vivo. Our work suggests a potential risk of SARS-CoV re-emergence from viruses currently circulating in bat populations.

Main
The emergence of SARS-CoV heralded a new era in the cross-species transmission of severe respiratory illness with globalization leading to rapid spread around the world and massive economic impact3,4. Since then, several strains—including influenza A strains H5N1, H1N1 and H7N9 and MERS-CoV—have emerged from animal populations, causing considerable disease, mortality and economic hardship for the afflicted regions5. Although public health measures were able to stop the SARS-CoV outbreak4, recent metagenomics studies have identified sequences of closely related SARS-like viruses circulating in Chinese bat populations that may pose a future threat1,6. However, sequence data alone provides minimal insights to identify and prepare for future prepandemic viruses. Therefore, to examine the emergence potential (that is, the potential to infect humans) of circulating bat CoVs, we built a chimeric virus encoding a novel, zoonotic CoV spike protein—from the RsSHC014-CoV sequence that was isolated from Chinese horseshoe bats1—in the context of the SARS-CoV mouse-adapted backbone. The hybrid virus allowed us to evaluate the ability of the novel spike protein to cause disease independently of other necessary adaptive mutations in its natural backbone. Using this approach, we characterized CoV infection mediated by the SHC014 spike protein in primary human airway cells and in vivo, and tested the efficacy of available immune therapeutics against SHC014-CoV. Together, the strategy translates metagenomics data to help predict and prepare for future emergent viruses.

The sequences of SHC014 and the related RsWIV1-CoV show that these CoVs are the closest relatives to the epidemic SARS-CoV strains (Fig. 1a,b); however, there are important differences in the 14 residues that bind human ACE2, the receptor for SARS-CoV, including the five that are critical for host range: Y442, L472, N479, T487 and Y491 (ref. 7). In WIV1, three of these residues vary from the epidemic SARS-CoV Urbani strain, but they were not expected to alter binding to ACE2 (Supplementary Fig. 1a,b and Supplementary Table 1). This fact is confirmed by both pseudotyping experiments that measured the ability of lentiviruses encoding WIV1 spike proteins to enter cells expressing human ACE2 (Supplementary Fig. 1) and by in vitro replication assays of WIV1-CoV (ref. 1). In contrast, 7 of 14 ACE2-interaction residues in SHC014 are different from those in SARS-CoV, including all five residues critical for host range (Supplementary Fig. 1c and Supplementary Table 1). These changes, coupled with the failure of pseudotyped lentiviruses expressing the SHC014 spike to enter cells (Supplementary Fig. 1d), suggested that the SHC014 spike is unable to bind human ACE2. However, similar changes in related SARS-CoV strains had been reported to allow ACE2 binding7,8, suggesting that additional functional testing was required for verification. Therefore, we synthesized the SHC014 spike in the context of the replication-competent, mouse-adapted SARS-CoV backbone (we hereafter refer to the chimeric CoV as SHC014-MA15) to maximize the opportunity for pathogenesis and vaccine studies in mice (Supplementary Fig. 2a). Despite predictions from both structure-based modeling and pseudotyping experiments, SHC014-MA15 was viable and replicated to high titers in Vero cells (Supplementary Fig. 2b). Similarly to SARS, SHC014-MA15 also required a functional ACE2 molecule for entry and could use human, civet and bat ACE2 orthologs (Supplementary Fig. 2c,d). To test the ability of the SHC014 spike to mediate infection of the human airway, we examined the sensitivity of the human epithelial airway cell line Calu-3 2B4 (ref. 9) to infection and found robust SHC014-MA15 replication, comparable to that of SARS-CoV Urbani (Fig. 1c). To extend these findings, primary human airway epithelial (HAE) cultures were infected and showed robust replication of both viruses (Fig. 1d). Together, the data confirm the ability of viruses with the SHC014 spike to infect human airway cells and underscore the potential threat of cross-species transmission of SHC014-CoV. ...")

МЮД (Украина)   14.04.2020 13:14

В настоящее время,и,наверное,ещё очень долго основным способом защиты от заражения коронавирусом является тканевая маска.Но она,являясь пассивным способом защиты, недостаточно эффективна и может успешно использоваться при соблюдении минимального расстояния между взаимодействующими объектами 2 метра.Это условие практически очень трудно,а иногда и невозможно соблюсти, при пользовании общественными предприятиями-магазинами,аптеками;общественным транспортом...Для повышения эффективности защитных масок при применении в соответствующих условиях их нужно активировать при помощи карманных пульверизаторов с раствором перекиси водорода,распыляемого на наружной поверхности масок. Достаточной концентрацией его является 3%.Такая концентрация применяется для обеззараживания ран и в небольших количествах даже для приёма вовнутрь.Внутри помещений при большом количестве посетителей должны устанавливаться стационарные распылители перекиси водорода,создающие из него аэрозольный туман.При этом воздух будет дезинфицироваться частично уже внутри тела человека и затем при выдыхании в окружающем пространство.

Дмитрий Воробьевский (Россия)   22.04.2020 10:58

https://iz.ru/1001343/2020-04-17/nobelevskii-laureat-zaiavil-ob-iskusstvennom-proiskhozhdenii-koronavirusa -- "Нобелевский лауреат указал на искусственное происхождение коронавируса".

Здравствуйте! Разумеется, едва ли какие-то "масоны" имеют к этому отношение...
Постепенно проясняется источник нынешней "пандемии коронавируса", разоряющей экономику и практически "обнуляющей" права человека. Уже довольно давно окончательно выяснилось, что именно в городе Ухани (где всё это началось) расположен главный китайский Институт Вирусологии -- с лабораториями, предназначенными для "изучения", как говорится, "особо опасных инфекций"...

Кроме того, несмотря на нынешний временный спад экономики, именно власти Китая -- как, впрочем, и других диктаторских государств (включая Россию, увы) -- являются, очевидно, главными, так сказать, выгодо-приобретателями от нынешней пандемии, поскольку именно диктаторские режимы, наиболее приспособленные для всевозможных запретов и репрессий, теперь -- в нынешних условиях -- получили вроде бы очевидные преимущества перед более-менее демократическими и либеральными странами (хотя в нормальных условиях, как известно, диктатуры проигрывают экономическое соревнование либеральным демократиям)...

Впрочем, конечно, нельзя пока полностью исключить и вероятность случайной "утечки" коронавируса из вышеупомянутого уханьского Института Вирусологии... Как, впрочем, нельзя исключить и вероятность того, что, так сказать, "интернациональную помощь" своим, как говорится, "китайским товарищам" вполне могли оказать в этом деле и представители путинского режима, имеющие большой опыт в осуществлении всевозможных "спецопераций", причём не только в России,... Кстати, на днях лабораторное происхождение "пандемии коронавируса", судя по сообщениям многих СМИ, было признано, в частности, одним из крупнейших телеканалов США "Фокс-Ньюс" и французским лауреатом Нобелевской премии вирусологом Люком Монтанье -- https://www.interfax.ru/world/704413 ("Fox News сообщил о лабораторном происхождении COVID-19"), https://iz.ru/1001343/2020-04-17/nobelevskii-laureat-zaiavil-ob-iskusstvennom-proiskhozhdenii-koronavirusa .

И ещё добавлю, что нынешняя всемирная так называемая "борьба с коронавирусом", очень похожая то ли на эпидемию истерии и шизофрении, то ли на приучение народов к тоталитаризму, на мой взгляд -- гораздо опаснее не только для экономики, но и вообще для человечества, чем сам этот коронавирус (вроде бы не очень сильно отличающийся по своей опасности от обычного гриппа)...

В качестве дополнения прилагаю ссылку на свою довольно старую небольшую статью "Не рукотворен ли китайский "коронавирус"?" -- http://maxpark.com/user/814874022/content/7011960 -- и пару ссылок на один из своих предыдущих "постов" по данной теме, а в самом конце -- и отрывок из того "поста":
https://www.facebook.com/dimvds/posts/2893477207365328 , https://ok.ru/profile/285190372887/statuses/151369700068631 .

Всем читателям -- всего самого хорошего!
Дмитрий Воробьевский, редактор самиздатской газеты "Крамола" (её блог: http://krrramola.livejournal.com/ ), г.Воронеж.

P.S. Пара ссылок на материалы об упомянутом здесь Уханьском "Институте вирусологии Китайской академии наук" -- https://ria.ru/20200219/1564981186.html , https://ru.wikipedia.org/wiki/Уханьский_институт_вирусологии .

P.P.S. И ещё три ссылки -- на довольно подробные публикации о вероятном происхождении "коронавируса", а также о его реальной опасности по сравнению с гриппом и с другими обычными болезнями -- https://www.inopressa.ru/article/31mar2020/washtimes/chinacoronavirus.html ("Китайские исследователи изучали смертоносные коронавирусы летучих мышей в лаборатории возле рынка животных в Ухане"), https://www.svoboda.org/a/30525376.html (""Он ведет себя необычно". Биолог об особенностях коронавируса"), https://habr.com/ru/post/494896/ ("Коронавирус: опасная иллюзия смертности").

_______________________
____________
_______



https://www.nature.com/articles/nm.3985 (Машинный перевод англоязычной научной статьи 2015 года об искусственной трансформации коронавируса летучих мышей в коронавирус, пригодный для того, чтобы вызвать эпидемию или даже пандемию среди людей. Согласно имеющимся данным, эти научные исследования были начаты в США, однако затем признаны незаконными, и их финансирование там было прекращено, в связи с чем они были продолжены в Институте вирусологии Китайской академии наук, в городе Ухани, где и началась нынешняя пандемия. Ссылка на комментарий в Фейсбуке, где можно прочитать о некоторых подробностях по данной теме -- https://www.facebook.com/dimvds/posts/2892204627492586?comment_id=2892258447487204 . Сначала прилагаю короткую цитату из этой статьи...):

"...Чтобы расширить эти данные, первичные культуры эпителия дыхательных путей человека (HAE) были инфицированы и показали надежную репликацию обоих вирусов (рис. 1d). Вместе эти данные подтверждают способность вирусов со Спайком SHC014 заражать клетки дыхательных путей человека и подчеркивают потенциальную угрозу межвидовой передачи SHC014-CoV. ..."
________________


"Опубликовано: 09 Ноября 2015 г. ..."
...

МЮД (Украина)   15.05.2020 11:50

Ещё одним конструктивным способом повышения эффективности защитных масок является изготовление их из токопроводящих тканей с подключением к низковольтному малогабаритному источнику электрического напряжения.Такие источники используются в телевидении
для дистанционной связи с участниками телепередач.Имеются научные данные о влиянии электрического потенциала на аэрозольную среду.Возможно, придание полярного заряда токопроводящей маске сделает её более эффективной при задержании проходящих через неё зараженных частиц.Эффективность маски должна увеличиваться при включении в её состав микроэлементов в виде тонких полос из различных материалов(лучше из металлов).При этом струи воздуха имеющие ламинарный характер при обтекании ворсинок цилиндрической формы меняют его на турбулентный и общее время контактирования содержащихся в проходящем через маску воздухе частиц с элементами масок увеличивается.Это даёт положительный эффект,если на маску нанесены дезинфицирующие средства.